ماهو PCR؟

 ماهو الPCR؟ و كيف يعمل؟ و ماهي فائدته ؟ 

Credit:Belova95
Pixabay.com

لقراءة ملخص الموضوع اضغط هنا 

1-مقدمة 

 توفر التقنيات الجديدة أو المحسنة الآن الوصول إلى المعلومات الجينية. يتم تجميع هذه التقنيات ، كل تقنية حديثة اكثر كفاءة من الاخرى ، لكنها كلها تعتبر جزء من   الهندسة الوراثية أو البيولوجيا الجزيئية. ازدهرت الهندسة الوراثية باختراع PCR. أصبح استهداف الجين وتضخيمه لاستخدامه لاحقًا أمرًا روتينيًا في مختبرات البيولوجيا الجزيئية.

الغرض من هذا المقل هو اعطاء فكرة عامة عن  PCR  و استعمالاته و عيوبه 

2-تعريف الPCR

Polymerase  Chain Reaction بالعربية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، هو تقنية تضخيم إنزيمي تجعل من الممكن الحصول على عدد كثير من النسخ المتطابقة من جزء من الحمض النووي. من 1 ميركوجرام من الحمض النووي يعيطنا مليارات من النسخ .

"تفاعل البوليميراز المتسلسل" ، هي تقنية للتكرار المستهدف في المختبر, إنه يجعل من الممكن الحصول ، من عينة معقدة ونادرة  ، على كميات كبيرة من جزء معين من الحمض النووي بطول محدد.  ليعطينا  مليون نسخة في بضع ساعات.

1-2 الهدف من PCR 

في علم الأحياء الجزيئي ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أحد أكثر التقنيات الأساسية تُستخدم لتضخيم  منطقة محددة  من حمض نووي معين من أجل الحصول على كمية كافية لاكتشافها ودراستها. تتكون تفاعلات PCR من عدة "دورات  تسمح بتكرار قالب DNA مزدوج الشريطة.

وبالتالي ، فإن منتجات PCR التي تم الحصول عليها في نهاية كل دورة تعمل كقالب للدورة التالية ، وبالتالي يكون التضخيم أسيًا.

2-2 تاريخ اكتشاف PCR 

كاري ميليس 

تم تطوير طريقة PCR للبيولوجيا الجزيئية في عام 1985 بواسطة كاري ميليس  ، شهدت هذه التقنية نقلة كبيرة في التسويق (حوالي عام 1988)  .

 -PCRهي تقنية أحدثت ثورة في البيولوجيا الجزيئية. في أقل من عشر سنوات ، هذه التقنية قادرة الآن على إنتاج أكثر من مليار نسخة في أقل من ساعة و كان على هذه التقنية عدة سنوات لتطويرها من اجل استخدامها بإعتبارها تقنية مستحدثة 

3- مبدأ PCR

الية عمل هذه التقنية متكونة من  ثلاث خطوات: فصل الحمض النووي عن طريق التسخين لفصل الروابط الهيدروجينية  ليصبح لدينا DNA بليف واحد ، وتهجين النكليوتيدات البادئة(Primer)  في نهايات التسلسل المطلوب ، ثم استطالة بفضل عمل إنزيم  بوليميريز الحمض النووي. في كل مرة نقوم بإعادة الدورة العديد  من المرات للحصول على مضاعفة أسية لتسلسل الحمض النووي المستهدف (مدة الدورة في حدود دقيقة).

4-مكونات الPCR

1-4-مصفوفة الحمض النووي DNA Matrix

إنه "المصدر" للحمض النووي ، الذي تقوم عليه العملية برمتها ، ويجب أن يكون مزدوج الشريطة Two Stranded ويتراوح حجمه بين أقل من 0.1 و عدد من الكيلوباز يبلغ إجمالي كمية الحمض النووي المستخدمة عادةً من 0.05 إلى 1.0 ميكروغرام ، مما يسمح باكتشاف نسخ مفردة من التسلسل المستهدف. على الرغم من أن العينة لا تحتاج إلى تنقية عالية ، إلا أنه يجب إزالة بعض الملوثات ، مثل الهيبارين ، والهيمس ، والفورمالين ، والمخلبات Mg2 + ، وكذلك المنظفات ، لتجنب تثبيط عملية التضخيم.

2-4- القطعة البادئة Primer 

هذا تسلسل مكمل للحمض النووي المراد تضخيمه ، وعادة ما يكون طوله من 16 إلى 30 نيوكليوتيد ، ويتراوح Tm بين 55 و 65 درجة مئوية. يجب أن تكون المسافة بين البادئات أقل من 10 كيلو باز. بشكل عام ، لوحظ انخفاض كبير في التضخيم عندما تكون  المسافة بين البادئات أكثر من حوالي 3 كيلو بايز. نستخدم قليل النوكليوتيدات عمومًا بتركيز 1 ميكرومتر في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهو ما يكفي لما لا يقل عن 30 دورة من التضخيم. يمكن أن يؤدي التركيز العالي من النوكليوتيدات إلى تضخيم التسلسلات غير المستهدفة غير المرغوب فيها. على العكس من ذلك ، يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل غير فعال عندما يكون تركيز البادئات  منخفضًا جدًا

3-4-إنزيم البوليمراز 

انزيم البوليمراز او مايسمى بطاك بوليمراز Taq Polymerase يستخرج من بكتيريا Thermus aquaticus  التي تعيش في وسط تصل حرارته الى 72 درجة يعمل هذا الانزيم على استطالة DNA الجديد عبر تركيب النكليوتيدات.

4-4- جهاز التنظيم الحراري 

-يحتوي على مكان حيث يمكنك التحكم فيه بدرجة الحرارة من 2 الى 98 درجة, توجد شاشة صغيرة و ازرار للتحكم بالدورات 

5-الية عمل PCR

المرحلة 1: يتم فيها رفع درجة الحرارة  الى 95 درجة و يتم فيها فصل الDNA  ليصبح كل ليف منفصل على الاخر 

المرحلة2: يتم فيها لصق البادئة في الليف المتسهدف ثم تغير درجة الحرارة بين 40 و 65 درجة من اجل التساق البادئة بشكل جيد

المرحلة 3: يقوم إنزيم البوليمراز Taq Polymerase بتركيب النكليوتيدات الحرة مما يؤدي الى استطالته و هكذا تتم الدورة و تعاد من 30 الى 50 مرة لتعطي تضخيم و اعداد كبيرة من نسخ الDNA  الاولي 

يوجد 35 نوعا من PCR لكل منها خصائصها و وظيفتها لكن الطريقة تبقى نفسها 

6-مجالات تطبيق PCR

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مفيدًا بشكل خاص عندما تتوفر المادة الوراثية بكميات صغيرة أو في حالة سيئة.نجد العديد من التطبيقات هي:

* الاستنساخ والتسلسل الجيني

* تشخيص الأمراض الوراثية

*تشخيص الامراض البكتيرية و معرفة اسباب الالتهبات 

* الكشف عن الطفرات

* الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا

* التعرف على الأفراد  (علم الطب الشرعي)

* تحديد النسب

* الطفرات الموجهة بالموقع (باستخدام البادئات الطافرة)

* وسم الحمض النووي (خاصة بالنسبة للبحوث الأساسية)

 .6- إجابيات PCR 

PCR هي تقنية حساسة للغاية لأنها قادرة على توليد كمية كبيرة جدًا من الحمض النووي من بضع نسخ من التسلسل المطلوب.

- دقيقة

• كمية قليلة من المادة الأولية: من كمية متناهية الصغر يتم إنتاج كمية كبيرة من المادة الوراثية.

• توفير الوقت / دراسة الأمصال: يتعرف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بسرعة على الأنواع الفيروسية المختلفة الموجودة

- السرعة

• توفير الوقت / وسط الزرع: القضاء على اوساط الزراعة  وأوقات الحضانة.

• استجابة سريعة للغاية

- النوعية

• تمييز

7-سلبيات PCR

يظل تفاعل البوليميراز المتسلسل أسلوبًا يصعب أحيانًا تنفيذه وتفسيره بسبب الحقيقة

- مخاطر التلوث الداخلي عند أخذ عينات من الحيوانات 

- التحلل المحتمل للأحماض النووية ، ولا سيما الحمض النووي الريبي ، وكذلك وجود مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في عينات معينة 

- تلوث سهل لوسط التفاعل أثناء التحليل المختبري 

8-الخاتمة 

يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أسلوبًا مخبريًا مثيرًا للاهتمام وفعالًا يتم ممارسته في ظل ضمان الجودة الشاملة  (عند استوفاء كل الشروط من اجل تجربة دقيقة ). 

-يمكن تنفيذه بالإضافة إلى طرق التشخيص الأخرى المتاحة.